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Preparações temporárias- corantes e algumas técnicas de montagem outubro 11, 2015

PREPARAÇÕES TEMPORÁRIAS

Em microscopia óptica as preparações podem ser temporárias ou definitivas, se apresentam, respectivamente, curta ou longa duração. Nas nossas aulas de microscopia, só realizaremos preparações do primeiro tipo.
As preparações temporárias permitem fazer a observação de células no seu meio normal de vida: água salgada, água doce, soro fisiológico ou plasma sanguíneo.
Por vezes, no estudo de microrganismos e de tecidos animais ou vegetais, temos necessidade de observar o material “in vivo” (ao vivo), no seu estado natural, sem uso de fixadores ou corantes que de algum modo sempre criam algo de artificial no material da observação.

A preparação temporária tem uma duração curta, isto porque pode ocorrer evaporação de meio aquoso, acompanhada de um processo de degradação da célula – decomposição – e autodestruição – autólise.

Técnicas para realizar preparações temporárias

Técnica de montagem___________________________________________________

O material a observar é colocado entre a lâmina e a lamela: segurando a lamela, com a ajuda de uma agulha de dissecção, de modo a que ela faça um ângulo de 45º com a lâmina, deixa-se cair lentamente. Esta técnica pode ser considerada como um complemento de outras.
T1

Técnica do esfregaço__________________________________________________

É uma técnica que permite a separação de células em meio líquido.
Consiste em espalhar um fragmento de tecido ou de uma colónia sobre uma lâmina de vidro, o que provoca a dissociação de alguns elementos celulares e a sua aderência ao vidro. Forma-se assim uma fina camada de células, facilitando a observação.
Este método é usado na observação de sangue e outros líquidos orgânicos, em que se coloca uma gota do líquido sobre uma lâmina, e com a ajuda de uma outra lâmina ou lamela se espalha bem. Depois de seco o material pode ser corado e fixado.

T2_Esfregaço

Técnica do esmagamento________________________________________________

Este método é usado nos casos em que existe uma aderência fraca entre as células do tecido a observar. Para visualizar as células, basta colocar um pequeno fragmento do tecido entre a lâmina e a lamela e fazer uma pequena pressão com o polegar. Provoca-se assim um esmagamento do tecido, o que faz com que as células se espalhem, formando uma fina camada, que é facilmente atravessada pela luz.
(Ex.: Polpa de Tomate)

T3_esmagamento

Técnica de cortes finos_______________________________________________

É uma técnica mais complexa e frequentemente usada em histologia. Consiste em cortar o material biológico em finas camadas, susceptíveis de serem atravessadas por raios luminosos.
Foi a técnica utilizada por Hooke na observação da cortiça e utiliza-se sempre que se pretende discernir por transparência os pormenores da estrutura celular de um órgão ou tecido que não é possível com a técnica de esmagamento (pois altera a ordem das células).
Contudo, deve-se ter em conta que se está a observar uma fina camada de uma célula ou organelo e que a realidade tridimensional pode ser muito diferente.
A fim de se obter cortes de espessura regular e finos usa-se um aparelho denominado micrótomo. O material a cortar é inserido em medula de sabugueiro e o conjunto é incluso no cilindro central oco do micrótomo de Ranvier. Para microscopia óptica fazem-se cortes de 5 a 12mm.
Com algum treino e perícia é possível obter cortes de boa qualidade para microscopia óptica usando simplesmente uma lâmina afiada.

Figura

Micrótomo de mão improvisado:_________________________________________
Realiza-se uma incisão longitudinal sobre um pequeno fragmento de medula de sabugueiro ou de uma rolha de cortiça. Na incisão introduz-se o material biológico a submeter a corte. Aperta-se com um fio todo o conjunto, apara-se o material que vai para além de face de corte e fazem-se cortes o mais finos possível.

T4_micrótomo

Muito importante: O meio de montagem poderá ser a água ou um corante de actuação rápida. Para observações mais prolongadas utilizam-se líquidos quimicamente mais complexos como o soro fisiológico, o soluto de Ringer, de Knopp ou Locke – líquidos conservadores.
O soluto de Ringer é um líquido fisiológico que permite manter as células vivas.

Vantagens do uso de preparações temporárias:__________________________
– A quantidade de artefactos que pode ser produzida é muito reduzida.
– Possibilita a visualização de material biológico “in vivo”, no seu estado natural.

Desvantagens do uso de preparações temporárias:_______________________
– As preparações não se conservam por muito tempo, mesmo quando se empregam líquidos conservantes; passado algum tempo começam a aparecer sinais de degenerescência, acabando com a morte do material biológico.
– Apenas se pode aplicar a material suficientemente transparente.
– As células grandes ou bastantes frágeis apresentam, por vezes artefactos devido ao peso da lamela.
– Não se pode observar no microscópio electrónico.

COLORAÇÃO_____________________________________________________________
Quando se observam ao microscópio óptico, preparações de material biológico fresco, pouco se distingue da estrutura interna das células, ao contrário do que acontece no microscópio electrónico.
As diferentes estruturas celulares apresentam pouco contraste óptico, isto é, têm um determinado grau de transparência à luz, de modo que, aparentemente, o conteúdo celular é homogéneo, por isso temos de recorrer a estratégias que permitam melhor visualização do conteúdo celular.
Para superar este problema os citologistas (cientistas que estudam a célula) desenvolveram técnicas de coloração que consistem em mergulhar a célula numa substância denominada corante, capaz de tingir diferencialmente uma ou mais partes celulares.
No microscópio electrónico não se usam corantes porque a imagem obtida é sempre a preto e branco.

Para realizar preparações temporárias utilizam-se corantes vitais porque podem ser usados em células vivas sem as matarem. Estão em concentrações muito baixas (0,01%), a fim de diminuir a toxicidade nas células.
Os corantes podem ser vitais ou não vitais, conforme permitam colorar células vivas e mantê-las assim ou não. O mesmo corante pode ser vital ou não, dependendo da concentração em que se encontra.
Ex.: Azul de metileno – pode ser um corante vital se estiver em baixa concentração. O soluto de lugol é um corante não vital pois mata rapidamente o material biológico.
Não existe uma técnica de coloração que ponha em evidência todas as estruturas celulares.
A coloração das células deve-se sobretudo à combinação dos corantes com as proteínas, dependendo portanto da sua carga eléctrica e pH. Por esta razão, o facto de os corantes poderem corar especificamente um organelo e não outro (corantes selectivos) está relacionado com a diferença de cargas eléctricas existente entre as proteínas dos diferentes organelos celulares, tendo os corantes uma especificidade para determinada carga eléctrica ou pH, que permita atracção pelo seu próprio e que ocorram ligações químicas.
Assim, quando colocamos corante azul numa preparação podemos verificar da início que toda a preparação fica azul, mas se lavarmos a preparação fazendo correr água pelo esguicho, o corante que não se encontra ligado a nenhuma estrutura sai.

Corantes selectivos:…………………………………………..

Corantes básicos ou nucleares
Azul de metileno—–Cora o núcleo de azul
Vermelho neutro——Acumula-se em vacúolos
Água iodada———-Cora o núcleo e amiloplastos

Os corantes básicos coram elementos celulares basófilos. As moléculas ácidas como o DNA e o RNA são basófilas, pois têm afinidade para os corantes básicos.

Corantes ácidos ou citoplasmáticos————————————
Eosina————–Citoplasma
Fucsina ácida——-Citoplasma
Os corantes ácidos coram elementos celulares acidófilos. O citoplasma tem proteínas básicas ou acidófilas.

Corantes neutros
Os corantes neutros coram elementos celulares neutrófilos

Violeta de Genciana——–Cromossomas de células vivas em divisão
Soluto de lugol————Grãos de amido, paredes celulósicas

Nota:
Os corantes também podem ser classificados de acordo com a sua origem e, deste modo, podem ser naturais (se provêm da natureza) ou artificiais (se são fabricados em laboratório).

Corantes naturais
Origem
Carmim—————Ovários de um insecto – Cochonilha
Hematoxilina———leguminosa
Anil—————–Anileira – papilionácea
Orceína————–Líquen
Açafrão————–Estames de Crocus sativus

Técnicas de coloração*************************************************

Na técnica de coloração por imersão o material biológico fica imerso durante alguns minutos no corante seleccionado.

figura

Na técnica de coloração por irrigação substitui-se o meio de montagem de uma preparação já efectuado por outro, que neste caso é o corante.

figura

FONTE: http://www.prof2000.pt/users/biologia/ptemporarias.htm

 

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